BCA蛋白定量檢測試劑盒
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
第1版（2016年04月修訂）
關(guān)聯(lián)信息
BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）是根據(jù)目前世界上最常用的兩種蛋白濃度檢測方法中的BCA（bicinchoninic acid，二喹啉甲酸）法研制而成，其基本原理是蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性環(huán)境下能與Cu2+ 生成絡合物，并將Cu2+還原成Cu+，BCA試劑會靈敏的與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定有顏色的復合物，并在562 nm 處有最大光吸收值，這樣通過判斷反應混合液顏色的深淺便能測定蛋白含量。該檢測試劑盒能對蛋白質(zhì)進行快速、穩(wěn)定、靈敏的濃度測定，檢測濃度下限最低達到20μg/ml，并在50-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。
試劑盒組分
| 名稱 | 規(guī)格 |
| BCA試劑A | 500ml |
| BCA試劑B | 15ml |
| BSA 標準品 | 10vails |
| 產(chǎn)品說明書 | 1 |
儲存及有效期
BCA試劑A、BCA試劑B室溫保存；BSA 標準品-20℃保存。試劑盒質(zhì)保期一年。
注：如果在寒冷天氣進行運輸，或在保存期間，試劑 A 或試劑 B 發(fā)生沉淀，可通過對溶液進行溫和加熱和攪拌，使沉淀溶解。當試劑盒發(fā)生變色或證明有微生物污染時，請將試劑丟棄。
樣本處理
1、將樣品的濃度稀釋或者濃縮到試劑盒的檢測范圍20-2,000μg/ml。
2、樣品中的干擾物質(zhì)不能含有或者超過額定量（詳細見附表）。
3、樣品中干擾物質(zhì)的處理方法：
1) 通過透析或凝膠過濾來除去干擾物質(zhì)；
2) 對樣品進行稀釋，直到該物質(zhì)不再產(chǎn)生干擾為止。只有當起始蛋白質(zhì)濃度足夠高，在稀釋以后，其濃度仍能保持在定量分析的范圍內(nèi)時，這種方法才有效；
3) 用丙酮或三氯乙酸（TCA）沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。將含有干擾物質(zhì)的液體成分丟棄，蛋白質(zhì)沉淀可復溶于超純水中，或直接溶解在堿性 BCA 工作液中；
4) 增加工作液中銅離子的含量（試劑 A 與試劑 B 的以 50:2 或 50:3 的比例混合制備工作液），這種方法可以消除銅螯合劑導致的干擾。
注：為了獲得最高的準確度，必須對蛋白質(zhì)標準物質(zhì)和待測樣品進行相同的處理。
試劑準備
1、標準品稀釋
按照下表制備一組蛋白質(zhì)標準品。向1瓶牛血清白蛋白標準品（BSA）中加入1 ml緩沖液，成為2mg/ml標準品，最好使用與待測樣品相同的緩沖液。每一支2 mg/ml 牛血清白蛋白標準品足夠用于制備下表中所列出的任意一組稀釋范圍的標準品；每個稀釋濃度的標準品的體積足夠用于3次重復檢測。
用于標準方案的稀釋方法如下：
| 標準液編號 | 稀釋液體積（μl） | 標準品體積（μl） | 標準液終濃度（μg/ml） |
| 1 | 0 | 300 | 2000 |
| 2 | 125 | 375μl of standard1 | 1500 |
| 3 | 325 | 325μl of standard 1 | 1000 |
| 4 | 175 | 175μl of standard 2 | 750 |
| 5 | 325 | 325μl of standard 3 | 500 |
| 6 | 325 | 325μl of standard 5 | 250 |
| 7 | 325 | 325μl of standard 6 | 125 |
| 8 | 400 | 100μl of standard 7 | 25 |
| 9 | 400 | 0 | 0 |
2、按50體積BCA試劑A加入1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
操作步驟
1、將樣品和標準品稀釋液按25μl/孔的要求，分別加入96T板的板孔內(nèi)；
2、各孔加入200μl BCA 工作液，置于水平搖床輕輕震蕩混勻，37℃放置30分鐘；
3、將96孔板冷卻至室溫，用酶標儀測定A562吸光度（如果沒有該波長，540nm-595nm之間的任意波長均可測定）
4、根據(jù)標準溶液吸光值和濃度制作標準曲線，計算待測樣品濃度(使用與酶標板相關(guān)聯(lián)的曲線擬合算法，二次方程等曲線擬合將會比簡單的線性擬合提供更加準確的結(jié)果。如果手工對這些結(jié)果作圖，對于標準曲線上的各個點，采取點對點描畫曲線的方法，比直接進行線性擬合的結(jié)果更好)
注意事項
1、標準曲線的線性范圍為20-2,000μg/ml。
2、樣品中各干擾檢測的物質(zhì)含量需低于臨界值。
3、BCA工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。
問題及解決方案
| 常見問題 | 原因 | 解決辦法 |
| 樣品不顯色 | 樣品中含有銅離子螯合劑 | 將樣品進行透析、脫鹽或者稀釋；加大工作液中銅離子的濃度，如將A液和B液的比例調(diào)整為50:2 |
| 樣本中蛋白濃度過低 | 濃縮樣本 | |
| 空白孔吸光值正常，標準品和樣品孔吸光值偏低 | 強酸或者強堿緩沖液改變了工作液的PH值 | 將樣品進行透析、脫鹽或者稀釋 |
| 選擇了錯誤的測定波長 | 在540nm-595nm之間的之間的波長范圍內(nèi)進行測定 | |
| 樣品孔吸光值偏高 | 蛋白濃度過高 | 將樣品進行稀釋 |
| 樣品中含有脂類或者脂蛋白 | 在樣品中加入2%SDS以去除脂類干擾 | |
| 所有孔包括空白孔呈現(xiàn)深紫色 | 樣品中含有還原劑或者胺類（如兒茶酚胺） | 將樣品進行透析或者稀釋 |
