CCK-8試劑盒

使用說明書

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

第1版（2016年04月修訂）

[產(chǎn)品信息]

WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。CCK-8試劑盒是一款基于WST-8顯色為基本原理，廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度檢測試劑盒。

[試劑組分]

組分	IS087-1（100次裝）	IS087-2（200次裝）	IS087-3（500次裝）
CCK8溶液	1ml	2ml	5ml
使用說明書	一份

[適用范圍]

藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。

[儲存及有效期]

-20℃避光保存，一年有效。

[實驗操作]

1. 取生長狀態(tài)良好的細胞制備成一定濃度的細胞懸液，每孔100ul加入96孔細胞培養(yǎng)板中。根據(jù)實驗需求，在培養(yǎng)孔中加入0-10ul待測的藥物繼續(xù)培養(yǎng)。

2. 將試劑盒中的CCK-8溶液取10ul加入96孔細胞培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5-4小時。

3. 在450nm測定吸光度。建議采用雙波長進行測定，檢測波長430-490nm，參比波長600-650nm。

[注意事項]

1. 通常細胞增殖實驗每孔加入2000個/100ul 細胞，細胞毒性實驗每孔加入5000/100ul 個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小、細胞增殖速度的快慢等因素決定)。

2. 如果是貼壁細胞，需要37℃培養(yǎng)箱進行預(yù)培養(yǎng)2-4小時等細胞貼壁后再開展實驗，如果是懸浮細胞，不需要預(yù)培養(yǎng)。

3. 如果是做細胞毒性試驗，加入毒性物質(zhì)后的培養(yǎng)時間需要摸索。要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細胞的敏感性，一般要根據(jù)細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間。

4. 如果細胞起始的培養(yǎng)體積為200ul，則需加入20ul的CCK-8溶液，其它情況以此類推。

5. 建議每個藥物濃度孔設(shè)置3個復(fù)制孔，最后取均值做曲線。

6. 設(shè)計好實驗對照，盡量排除其它因素的干擾：1）空白對照：可以用加了等量細胞培養(yǎng)液、CCK-8溶液和藥物但沒有加細胞的孔；2）陰性對照：不加藥物但加了藥物溶劑的細胞孔。

7. 本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng)，如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性，可能會干擾檢測，需設(shè)法去除（加入CCK-8溶液之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物影響。如果藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可）。

8. 加入CCK-8溶液后注意孵育時間。對于大多數(shù)情況孵育1小時就可以了。時間的長短根據(jù)細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時后分別用酶標(biāo)儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗。

9. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。

10. 若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10ul 10% SDS溶液終止反應(yīng)，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會變化太大，一般還是建議立刻檢測。

11. 用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡，否則會干擾測定。