PEG1450溶液（50%）

使用說明書

僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

第1版（2016年04月修訂）

[關(guān)聯(lián)信息]

PEG1450溶液（50%，無菌）主要由PEG1450（CAS號(hào)25322-68-3）、磷酸鹽等組成，其作用原理使能夠改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，兩細(xì)胞接口處在雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的表面張力作用下，細(xì)胞發(fā)生融合。在單克隆抗體制備過程中，PEG1450可作為融合劑，誘導(dǎo)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合，以獲得生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。

[制品內(nèi)容]

編號(hào)	名稱	規(guī)格
IS097-1	PEG1450溶液（50%，無菌）	10ml
IS097-2	PEG1450溶液（50%，無菌）	10*10ml

[儲(chǔ)存及有效期]

4℃保存，有效期6個(gè)月。

[使用方法]

單層貼壁細(xì)胞

1、將雜交前體細(xì)胞以相同數(shù)量（5×10⁴/ml）接種，以適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng) 細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁擴(kuò)展至匯合成片（80%匯合率）的密度。

2、吸干培養(yǎng)液，加入 PEG1450溶液（50%，無菌），輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)1min使PEG1450溶液覆蓋所有細(xì)胞。

3、靜置1min，加入完全MEM培養(yǎng)液以稀釋PEG1450溶液，吸干凈稀釋的PEG1450溶液，再用5ml MEM培養(yǎng)液洗滌被PEG處理的細(xì)胞。

4、吸干凈洗液，加入 MEM培養(yǎng)液，37℃，5% CO2培養(yǎng)過夜。

5、24~48h后先吸去培養(yǎng)液，加入胰酶消化液處理細(xì)胞，待細(xì)胞消化后吸除胰酶消化液，用HAT選擇培養(yǎng)剔除HPRT和TK缺陷細(xì)胞。

6、棄上清液，用補(bǔ)加1×HT和1×A的完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。融合后進(jìn)行異核體分析，雜交前體細(xì)胞在4~5天內(nèi)發(fā)生死亡。  

懸浮細(xì)胞

1、將兩種不同親體的細(xì)胞各1ml（約為1×10⁷）混勻，離心以沉淀雜交前體細(xì)胞，棄上清液，使之剩余約1ml，手指輕彈管底或手搖離心管使兩種細(xì)胞混勻并重新懸浮。

2、在離心管中加入1ml PEG1450溶液（50%，無菌），置于37℃水浴，加入提前37℃預(yù)熱的含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，使PEG1450稀釋并停止作用。

3、離心，棄上清液，加入5ml完全MEM培養(yǎng)液以稀釋PEG1450溶液，吸干凈稀釋的PEG1450溶液。

4、用5ml無血清MEM培養(yǎng)液，手搖離心管重懸細(xì)胞(不要破壞細(xì)胞)，1000g離心5min，棄上清液，重復(fù)1次該步驟。加入含有胎牛血清的HAT選擇培養(yǎng)基，混勻，將細(xì)胞懸液用培養(yǎng)液稀釋至5×10⁴/ml，接種于96孔板，37℃ 5% CO2孵育過夜24~48h后選出融合細(xì)胞。   

 

[注意事項(xiàng)]

1、應(yīng)注意無菌操作，避免被微生物污染；  

2、PEG1450溶液較為粘稠時(shí)，可37~60℃水浴使其變成溶液；  

3、體外培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞均可做融合，但成功概率較大的是單層貼壁細(xì)胞； 

4、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室安全操作手冊(cè)進(jìn)行。